Clonarea genelor este actul de a face copii sau clone ale unei singure gene. Odată identificată o genă, clonele pot fi utilizate în multe domenii ale cercetării biomedicale și industriale. Ingineria genetică este procesul de clonare a genelor în noi organisme sau modificarea secvenței ADN pentru a schimba produsul proteic. Ingineria genetică depinde de capacitatea noastră de a efectua următoarele proceduri esențiale.
01 Reacția lanțului de polimerază
02 Enzime de restricție
Descoperirea enzimelor cunoscute ca endonucleaze de restricție a fost esențială pentru ingineria proteinelor . Aceste enzime taie ADN-ul în locații specifice pe baza secvenței de nucleotide. Sute de enzime de restricție diferite, capabile să taie ADN la un loc distinct, au fost izolate din multe tulpini diferite de bacterii. ADN-ul tăiat cu o enzimă de restricție produce multe fragmente mai mici, de dimensiuni diferite. Acestea pot fi separate prin electroforeză pe gel sau cromatografie.
03 Electroforeza
ADN-ul purificat dintr-o cultură celulară sau tăierea acestuia folosind enzime de restricție nu ar fi de mare folos dacă nu am putea vizualiza ADN-ul - adică găsim o modalitate de a vedea dacă extractul conține sau nu ceva sau ce dimensiuni vă fragmentează Voi l-ați tăiat. O modalitate de a face acest lucru este prin electroforeza pe gel. Gelele sunt folosite pentru o varietate de scopuri, de la vizualizarea ADN-ului tăiat la detectarea inserțiilor ADN și a knockouts-urilor.
04 Alăturați-vă două bucăți de ADN
În cercetarea genetică este adesea necesar să se conecteze două sau mai multe fire individuale de ADN, să se creeze o catenă recombinantă sau să se închidă o catenă circulară care a fost tăiată cu enzime de restricție. Enzime numite ligaze ADN pot crea legături covalente între lanțurile de nucleotide. Enzimele ADN polimeraza I și polinucleotid kinaza sunt, de asemenea, importante în acest proces, pentru umplerea golurilor sau pentru fosforilarea capetelor 5 ', respectiv.
05 Selectarea ADN-ului cu auto-replicare mic
Micile bucăți circulară de ADN care nu fac parte dintr-un genom bacterian, dar sunt capabile de auto-replicare, sunt cunoscute sub denumirea de plasmide. Plasmidele sunt adesea folosite ca vectori pentru a transporta gene între microorganisme. În biotehnologie, odată ce gena de interes a fost amplificată și atât gena cât și plasmida sunt tăiate cu enzime de restricție, ele sunt ligate împreună generând ceea ce este cunoscut ca un ADN recombinant. Anticorpul viral (bacteriofag) poate fi de asemenea utilizat ca vector, cum ar fi cosmidele, plasmidele recombinante care conțin genele bacteriofag.
06 Metoda de mutare a unui vector într-o celulă gazdă
Procesul de transfer al materialului genetic pe un vector cum ar fi o plasmidă, în celule gazdă noi, se numește transformare. Această tehnică necesită ca celulele gazdă să fie expuse la o schimbare de mediu care le face "competente" sau temporar permeabile la vector. Electroporația este o astfel de tehnică. Cu cât plasmida este mai mare, cu atât este mai redusă eficiența cu care este preluată de celule. Segmentele ADN mai mari sunt mai ușor clonate utilizând bacteriofagi, retrovirusuri sau alți vectori virali sau cosmide într-o metodă numită transducție. Fagii sau vectorii virali sunt adesea utilizați în medicina regenerativă, dar pot provoca inserția ADN-ului în părțile cromozomilor noștri, în cazul în care nu-l dorim, provocând complicații și chiar cancer.
07 Metodele de selectare a organismelor transgenice
Nu toate celulele vor prelua ADN-ul în timpul transformării. Este esențial să existe o metodă de detectare a celor care o fac. În general, plasmidele poartă gene pentru rezistența la antibiotice și celulele transgenice pot fi selectate pe baza exprimării acelor gene și a capacității lor de a crește pe medii care conțin acest antibiotic. Metodele alternative de selecție depind de prezența altor proteine reporter, cum ar fi sistemul x-gal / lacZ sau proteina de fluorescență verde, care permit selecția bazată pe culoare și fluorescență, respectiv.