Ce PCR are de a face cu secvențierea ADN-ului și amplificarea genelor
Reacția în lanț a polimerazei ( PCR ) este o tehnică moleculară genetică pentru a face mai multe copii ale unei gene și este de asemenea parte a procesului de secvențiere a genei.
Cum funcționează reacția lanțului de polimerază?
Copiile genetice se fac folosind un eșantion de ADN, iar tehnologia este suficient de bună pentru a face mai multe copii dintr-o singură copie a genei găsită în eșantion. Amplificarea PCR a unei gene pentru a face milioane de exemplare permite detectarea și identificarea secvențelor genice folosind tehnici vizuale bazate pe mărimea și încărcarea (+ sau -) a piesei de ADN.
În condiții controlate, segmente mici de ADN sunt generate de enzime cunoscute ca ADN polimeraze, care adaugă deoxynucleotide complementare (dNTPs) la o bucată de ADN cunoscută sub numele de "șablon". Chiar și fragmente mai mici de ADN, numite "primeri", sunt utilizate ca punct de plecare pentru polimerază. Primerii sunt mici bucăți de ADN (oligomeri), de obicei între 15 și 30 de nucleotide. Acestea sunt realizate prin cunoașterea sau ghicirea secvențelor scurte de ADN la extremitățile genei care se amplifică. În timpul PCR, ADN-ul care a fost secvențiat este încălzit și dublurile separate. După răcire, primerii se leagă de șablon (numit recoacere) și creează un loc pentru începerea polimerazei.
Tehnica PCR
Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost posibilă prin descoperirea de termofile și enzime termofile de polimerază (enzime care mențin integritatea structurală și funcționalitatea după încălzire la temperaturi ridicate).
Etapele implicate în tehnica PCR sunt următoarele:
- Se creează un amestec, cu concentrații optimizate ale șablonului ADN, enzimei polimerazice, primerilor și dNTPs. Abilitatea de a încălzi amestecul fără denaturarea enzimei permite denaturarea elicopterului dublu al probei de ADN la temperaturi cuprinse între 94 grade Celsius.
- După denaturare, proba este răcită până la un interval mai moderat, în jur de 54 de grade, ceea ce facilitează recoacerea (legarea) primerilor la șabloanele ADN monovalent.
- În a treia etapă a ciclului, proba este reîncălzită la 72 de grade, temperatura ideală pentru polimeraza DNA Taq, pentru alungire. În timpul alungirii, ADN polimeraza folosește singura catenă originală de ADN ca șablon pentru a adăuga dNTP complementare la capetele 3 'ale fiecărui primer și a genera o secțiune de ADN dublu catenar în regiunea genei de interes.
- Grundurile care au recoapat la secvențele ADN care nu sunt o potrivire exactă nu rămân annelate la 72 de grade, limitând astfel alungirea la gena de interes.
Acest proces de denaturare, recoacere și alungire este repetat de mai multe ori (30-40), crescând astfel exponențial numărul de copii ale genei dorite în amestec. Deși acest proces ar fi destul de obositor dacă este efectuat manual, probele pot fi preparate și incubate într-un termociclu programabil, acum obișnuit în majoritatea laboratoarelor moleculare, și o reacție PCR completă poate fi efectuată în 3-4 ore.
Fiecare etapă de denaturare oprește procesul de alungire a ciclului precedent, trunchind astfel noua bandă a ADN-ului și menținând-o la aproximativ dimensiunea genei dorite.
Durata ciclului de alungire poate fi mai lungă sau mai scurtă în funcție de dimensiunea gena de interes, dar în cele din urmă, prin cicluri repetate de PCR, majoritatea șabloanelor vor fi limitate doar la dimensiunea geniului de interes, deoarece acestea vor fi generate de produsele ambelor primeri.
Există mai mulți factori diferiți pentru PCR de succes care pot fi manipulați pentru a spori rezultatele. Metoda cea mai răspândită pentru testarea prezenței produsului PCR este electroforeza pe gel de agaroză . Care se utilizează pentru a separa fragmentele ADN pe baza mărimii și încărcării. Fragmentele sunt apoi vizualizate utilizând coloranți sau radioizotopi.
Evolutia
De la descoperirea PCR, au fost descoperite ADN polimeraze altele decât Taq originale. Unele dintre acestea au o capacitate mai bună de "corectare" sau sunt mai stabile la temperaturi mai ridicate, îmbunătățind astfel specificitatea PCR și reducând erorile din inserarea dNTP-ului incorect.
Unele variante de PCR au fost concepute pentru aplicații specifice și sunt utilizate în mod regulat în laboratoarele moleculare genetice. Unele dintre acestea sunt PCR în timp real și PCR cu revers-transcriptază. Descoperirea PCR a condus, de asemenea, la dezvoltarea secvențierii ADN-ului, a amprentelor ADN și a altor tehnici moleculare.