Ajustările la oricare dintre componentele unei reacții de reacție în lanț de polimerizare (PCR) pot modifica calitatea rezultatului, fie prin îmbunătățirea sau diminuarea randamentului și a calității produsului, fie prin îmbunătățirea specificității și sensibilității reacției. Parametrii care influențează rezultatul final pot fi fie fizic (adică temperatura, ciclurile de timp) sau chimice (adică concentrația șablonului, tipul enzimei utilizate). Următoarele sunt câțiva factori cheie care influențează succesul PCR.
01 Condiții de laborator nepoluante
Deoarece PCR este capabil să detecteze o singură moleculă de ADN, este important să se mențină condițiile de laborator în laborator. Întotdeauna purtați mănuși proaspete, folosiți sticlă sterilă, tuburi și vârfuri de pipetă și soluții sterile și curățați zona de lucru înainte de a începe lucrul.
Întotdeauna includeți reacțiile de control, fără ADN șablon și fără enzime, pentru a vă asigura că rezultatele se datorează într-adevăr amplificării probei corecte.
Majoritatea oamenilor se asigură că au propriul lor set de soluții care nu sunt partajate pentru a facilita depanarea, iar pipetele desemnate sunt deseori alocate doar pentru PCR. Tuburile PCR fără tub de PCR și fără gaz de RNase, vârfurile de pipetă rezistente la aerosoli și lucrul într-o capotă de fum cu lumină UV sunt de asemenea modalități de a minimiza problemele.
02 Componente chimice
- Aveți între 18 și 24 de baze
- Nu au o structură secundară (de exemplu, bucle de ac de păr)
- Distribuție echilibrată a perechilor G / C și A / T
- Nu sunt complementare unul la altul la capetele de 3 metri
- Au temperaturi de topire (Tm) de aproximativ 5-10 grade Celsius sub temperatura de recoacere, care este de obicei între 55 și 65 de grade Celsius
Tm pentru ambii primeri ar trebui să fie, de asemenea, similar pentru cele mai bune rezultate.
03 Reaction Mix: Șablon și grunduri
Concentrațiile optimale ale primerului sunt cuprinse între 0,1 și 0,6 micromoli / L. Cantitatea de șablon variază în funcție de tipul de ADN (uman, bacterian, plasmid).
Cu cantități foarte scăzute de șablon, există și alte strategii pentru îmbunătățirea rezultatelor, cum ar fi numerele crescute ale ciclului sau utilizarea "începutului la cald". Testați întotdeauna noii primeri cu o reacție de control pozitivă, pentru a vă asigura că lucrează în condițiile experimentale specifice.
04 Reaction Mix: Activitatea enzimatică
Concentrația de MgCl2 în amestecul de reacție poate influența rezultatul PCR și poate juca un rol important în reacțiile mai dificile. Cationul de magneziu formează complexe solubile cu dNTP pentru a produce substratul real pe care îl recunoaște enzima polimerazică.
Cantități egale din toate cele patru dNTP-uri contribuie, de asemenea, la reducerea ratei de eroare a polimerazei. Anumiți aditivi cum ar fi betaină, BSA, detergenți, DMSO, glicerol și pirofosfatază pot afecta, de asemenea, specificitatea enzimei sau eficiența reacției.
05 Tipul termociclului
Atunci când faceți cumpărături pentru echipamente de laborator, rețineți că unele termociclete sunt mai puțin precise decât altele pentru menținerea temperaturilor exacte și dorite.
Aceasta este o zonă în care mergerea ieftină nu se va achita pe termen lung atunci când vă confruntați cu o reacție finică sau folosind grunduri care necesită o gamă îngustă de temperatură de recoacere.
Tuburile de reacție cu pereți subțiri, concepute pentru a se potrivi cu marca exactă a termociclului pe care îl utilizați, ajută de asemenea la optimizarea temperaturilor de reacție.
06 Setările ciclului
Randamentul crescut poate fi obținut prin creșterea timpului de extindere la fiecare 20 de cicluri, pentru a compensa mai puțin enzima pentru a amplifica mai mult șablon. De obicei, mai puțin de 40 de cicluri este suficientă pentru a amplifica mai puțin de 10 molecule de șablon într-o concentrație suficient de mare pentru a vedea pe un gel de agaroză colorat cu bromură de etidiu.