Gradul de puritate a proteinei cerut depinde de destinația finală a proteinei.
Pentru unele aplicații, un extract brut este suficient. Cu toate acestea, pentru alte utilizări, cum ar fi produsele alimentare și produsele farmaceutice, este necesar un nivel ridicat de puritate. Pentru a realiza acest lucru, mai multe metode de purificare a proteinelor sunt utilizate în mod tipic, într-o serie de etape de purificare.
Fiecare etapă de purificare a proteinei determină, de obicei, un anumit grad de pierdere a produsului. Prin urmare, o strategie ideală de purificare a proteinelor este cea în care cel mai înalt nivel de purificare este atins în cele mai puține etape. Selectarea etapelor de utilizare depinde de mărime, încărcare, solubilitate și alte proprietăți ale proteinei țintă. Următoarele tehnici sunt cele mai potrivite pentru purificarea unei singure proteine citosolice. Purificarea complexelor proteice citosolice este mai complicată și necesită de obicei aplicarea unor metode diferite.
Primii pași pentru purificarea proteinei
Primul pas în purificarea proteinelor intracelulare (în celulă) este prepararea unui extract brut .
Extractul va conține un amestec complex de proteine din citoplasma celulară și unele macromolecule suplimentare, cofactori și nutrienți. Extractul brut poate fi utilizat pentru unele aplicații în biotehnologie, totuși, dacă puritatea este o problemă, trebuie urmate etapele de purificare ulterioare.
Extractele de proteine brute sunt preparate prin îndepărtarea resturilor celulare generate de liza celulară, obținută prin utilizarea de substanțe chimice și enzime , prin sonicare sau printr-o presă franceză. Resturile se îndepărtează prin centrifugare și se recuperează supernatantul. Preparatele crude ale proteinelor extracelulare pot fi obținute prin simpla îndepărtare a celulelor prin centrifugare.
Pentru anumite aplicații biotehnologice , există o cerere pentru enzime termostabile : Enzime care pot tolera temperaturi ridicate fără denaturare și menținând în același timp o activitate specifică ridicată. Organismele care le produc sunt uneori numite extremofile. O abordare ușoară a purificării unei proteine rezistente la căldură este aceea de a denatura celelalte proteine din amestec prin încălzire, apoi răcirea soluției (permițând astfel enzimei termostabile să se reformuleze sau să se redesolve, dacă este necesar.) Proteinele denaturate pot fi apoi îndepărtate prin centrifugare.
Etapele de purificare intermediară
În trecut, o a doua etapă obișnuită de purificare a unei proteine dintr-un extract brut a fost prin precipitare într-o soluție cu o rezistență osmotică mare (adică soluții de sare). Acizii nucleici din extractul brut pot fi îndepărtați prin precipitarea agregatelor formate cu sulfat de streptomicină sau sulfat de protamină.
Precipitarea proteinelor se face, de obicei, folosind sulfat de amoniu ca sare.
Diferitele proteine vor fi precipitate în diferite concentrații de sulfat de amoniu . În general, proteinele cu precipitare cu greutate moleculară mai mare la concentrații mai scăzute de sulfat de amoniu. Precipitațiile de sare nu conduc de obicei la o proteină foarte purificată, dar pot ajuta la eliminarea unor proteine nedorite într-un amestec și la concentrarea probei. Sărurile din soluție sunt apoi îndepărtate prin dializă prin tubulatură de celuloză poroasă, prin filtrare sau prin cromatografie cu gel de excludere.
Protocoalele biotehnologice moderne profită adesea de numeroasele kituri disponibile în comerț care oferă soluții gata pentru procedurile standard. Purificarea proteinei este adesea efectuată utilizând filtre și coloane de filtrare a gelului preparate. Tot ce trebuie să faceți este să urmați instrucțiunile și să adăugați volumul potrivit al soluției potrivite și să așteptați durata de timp specificată în timp ce colectați eluentul (ceea ce se află la celălalt capăt al coloanei) într-o eprubetă proaspătă.
- Metodele cromatografice pot fi aplicate utilizând coloane de tip bench-top sau echipament HPLC automatizat. Separarea prin HPLC poate fi realizată prin metode de fază inversă, de schimb de ioni sau de excludere a mărimii și probe detectate prin matrice de diode sau prin tehnologie laser.
Vizualizarea proteinelor și evaluarea purificării
- Cromatografia în fază inversă (RPC) separă proteinele pe baza hidrofobicităților lor relative. Această tehnică este foarte selectivă, dar necesită utilizarea de solvenți organici. Unele proteine sunt denaturate permanent de solvenți și vor pierde funcționalitatea în timpul RPC. Prin urmare, această metodă nu este recomandată pentru toate aplicațiile, în special dacă este necesară pentru reținerea proteinei țintă.
- Cromatografia cu schimb de crom se referă la separarea proteinelor pe bază de încărcare . Coloanele pot fi pregătite fie pentru schimb de anioni, fie pentru schimb de cationi. Coloanele de schimb anionic conțin o fază staționară cu o sarcină pozitivă care atrage proteine încărcate negativ. Coloanele cu schimb de cationi sunt margele inversate, inversate negativ, care atrag proteine incarcate pozitiv. Eluarea proteinei (țintălor) țintă se face prin modificarea pH-ului în coloană, ceea ce conduce la o schimbare sau neutralizare a grupelor funcționale încărcate ale fiecărei proteine.
- Cromatografia de excludere a mărimii ( filtrare pe gel ) separă proteinele mai mari de cele mici, deoarece moleculele mai mari se deplasează mai rapid prin polimerul reticulat în coloana de cromatografie. Proteinele mari nu se încadrează în porii polimerului, în timp ce proteinele mai mici fac și necesită mai mult timp pentru a călători prin coloana de cromatografie, prin traseul lor mai puțin direct. Eluatul este colectat într-o serie de tuburi care separă proteine pe baza timpului de eluare. Gelul de filtrare este un instrument util pentru concentrarea unei probe de proteină, deoarece proteina țintă este colectată într-un volum de eluare mai mic decât a fost adăugat inițial în coloană. Tehnicile de filtrare similare pot fi utilizate în timpul producției de proteine pe scară largă din cauza rentabilității lor.
- Cromatografia cu afinitate este o tehnică foarte utilă pentru "lustruirea" sau pentru completarea procesului de purificare a proteinelor. Granulele din coloana de cromatografie sunt reticulate cu liganzi care se leagă în mod specific la proteina țintă. Proteina este apoi îndepărtată din coloană prin clătire cu o soluție conținând liganzi liberi. Această metodă oferă cele mai pure rezultate și cea mai mare activitate specifică în comparație cu alte tehnici.
- SDS-PAGE este electroforeza pe gel de poliacrilamidă, efectuată în prezența SDS (dodecil sulfat de sodiu) care se leagă la proteine, oferindu-le o încărcare negativă netă mare. Deoarece încărcăturile tuturor proteinelor sunt destul de egale, această metodă le separă aproape în întregime pe baza dimensiunilor. SDS-PAGE este adesea folosit pentru a testa puritatea proteinei după fiecare etapă dintr-o serie. Deoarece proteinele nedorite sunt îndepărtate treptat din amestec, numărul de benzi vizualizate pe gelul SDS-PAGE este redus, până când nu există decât o singură bandă reprezentând proteina dorită.
- Imunoblottingul este o tehnică de vizualizare a proteinei aplicată în combinație cu cromatografia de afinitate. Anticorpii pentru o proteină specifică sunt utilizați ca liganzi pe o coloană de cromatografie de afinitate. Proteina țintă este reținută pe coloană, apoi este îndepărtată prin clătirea coloanei cu o soluție de sare sau alți agenți. Anticorpii legați de etichetele radioactive sau de coloranți ajută la detectarea proteinei țintă odată ce aceasta este separată de restul amestecului.
surse:
Zubay G. 1988. Biochimie, ediția a doua. Macmillan Publishing Co., New York, NY, SUA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Manual de purificare a proteinelor, Ediția AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, SUA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.